Kako su ORFS i adapteri koji se koriste u izgradnji Crispr - Biblioteka sa sjedištem u Crispr-u?

Crispr (klasterirano redovito isprepletene kratke palindromičke ponavljane) tehnologija revolucionirala je polje genetskog inženjerstva, nudeći moćan alat za uređivanje gena, regulaciju gena i funkcionalne genomičke studije. Izgradnja biblioteka zasnovanih na CRISPR-u je ključni korak u velikim - genetskim ekranima skale, omogućavajući istraživačima da sistematski ispituju funkciju gena u cijelom genom. U ovom blogu ćemo istražiti kako se otvoreni okviri za čitanje (ORFS) i adapteri koriste u izgradnji CrisPr - biblioteka na bazi Crispr i takođe uvode našu ponudu kao dobavljača ORF-a i adaptera.

Razumijevanje ORF-a u CrisPr-u izgradnju biblioteke na bazi

Otvoreni okviri za čitanje (ORFS) su dijelovi gena DNK sekvenca koji se mogu prevesti u proteine. U kontekstu izgradnje biblioteke CRISPR - ORF-a igraju vitalnu ulogu u dobitku - od - Function (GOF) ekrana. Ovi ekrani imaju za cilj identificirati gene koji, kada su prekomjerni izduženi, konkretnu fenotip, poput povećane proliferacije ćelija, otpornost na lijek ili izmijenjenu morfologiju ćelije.

Za izgradnju CRISPR-ove biblioteke zasnovane na GOF-u, ORF-ovi su prvi izolirani iz CDNA biblioteke ili sintetizirane de novo. ORF-ovi se zatim kloniraju u odgovarajući vektor, često lentivirusni ili retrovirusni vektor koji može efikasno dostaviti genetski materijal u ciljane ćelije. Vektor sadrži regulatorne elemente, kao što su promotor, za pokretanje izraza umetne ili umetne.

Proces kloniranja ORF-a u vektor obično uključuje probavu i obradu ograničenja enzima i udjela. ORF se probavlja sa specifičnim enzimima ograničenja, koji stvaraju kompatibilne krajeve s probavljenim vektorom. Dva fragmenta DNK-a se zatim nalaze zajedno koristeći DNK ligazu, formirajući rekombinantni plazmid. Ovaj plazmid može se dalje pojačati u bakterijama, a zatim se pakirati u virusne čestice za dostavu u ćelije.

Jednom kada se uvedeni vektorima ili sadrže vektore u stanice, orfovi su prepisani i prevedeni u proteine. Screening veliki broj ćelija koji izražava različite orfove, istraživači mogu identificirati gene koji su povezani sa željenim fenotipom. Ovaj pristup korišten je za otkrivanje romana vozača raka, gena koji su uključeni u imunološke odgovore i regulatore diferencijacije matičnih ćelija.

Uloga adaptera u CRISPR - izgradnje biblioteke na bazi

Adapteri su kratki DNK sekvenci koji se koriste za izmjenu DNK fragmenata tokom konstrukcije biblioteke. U kontekstu biblioteka zasnovanih na CrisPr - adapteri služe nekoliko važnih funkcija.

1. Linker adapteri za kloniranje

Kada se kloniraju ili drugi fragmenti DNK u vektoru, adapteri za povezivanje mogu se koristiti za stvaranje kompatibilnih krajeva između umetka i vektora. Na primjer, ako ili vektor i vektor imaju različita mjesta za ograničenje, adapteri za povezivanje mogu se dizajnirati tako da imaju jedan kraj kompatibilan sa ORF-om, a drugi kraj kompatibilni sa vektorom. To omogućava efikasno ubacivanje udjela u vektor, čak i kada prirodni krajevi nisu izravno kompatibilni.

2. Adapteri za barkod za multipleksiranje

U velikim - Crispp ekranima, često je potrebno višestruko višestruki uzorci ili biblioteka. Adapteri za barkode koriste se za označavanje svakog pojedinačnog fragmenta ili biblioteke DNK s jedinstvenim redoslijedom barkoda. Ovi barkodovi omogućavaju identifikaciju i praćenje svakog uzorka tokom sekvenciranja i analize podataka. Na primjer, u zaslonu Crispr-a mogu se označiti različite stanice ili eksperimentalni uvjeti ili eksperimentalni uvjeti s različitim barkodovima. Nakon sekvenciranja, informacije o barkodu mogu se koristiti za utvrđivanje koji čitanje pripada kojem uzorku omogućavajući usporedbu različitih uvjeta u jednom pokrenu.

3. Adapteri za pojačavanje za PCR

PCR pojačalo je zajednički korak u konstrukciji biblioteke za povećanje količine DNK. Adapteri za pojačavanje dizajnirani su za prikupljanje na krajevima fragmenata DNK i služe kao temeljni premaza za PCR. Ovi adapteri mogu ugraditi i dodatne elemente, kao što su sekvenciranje veza za obvezuju za rezanje ili jedinstvene molekularne identifikatore (UMIS). UMIS su nasumične sekvence koji se dodaju u svaku molekulu DNK tokom pripreme biblioteke. Oni se mogu koristiti za ispravljanje PCR pojačanja i pogreške u sekvenciranju, poboljšavajući tačnost kvantifikacije i analize.

Naša ponuda kao dobavljač orfa i adaptera

Kao vodeći dobavljač ORF-a i adaptera nudimo širok spektar proizvoda za podršku CRISPR - biblioteci utemeljenoj u vezi. Naši se ORF-ovi pažljivo kucaju i potvrđuju kako bi se osigurale visoke kvalitetne i pune sekvence dužine. Nudimo ORF-ove iz različitih vrsta, uključujući ljudski, miš i štakor, a može pružiti i prilagođene - sintetizirane ORF-ove na osnovu određenih zahtjeva kupaca.

Naši adapteri dizajnirani su preciznom i dostupni su u različitim formatima kako bi se zadovoljile raznolike potrebe izgradnje biblioteke. Bilo da su vam potrebni jarkolice za kloniranje, adaptere za barkod za multipleksiranje ili adaptere pojačanja za PCR, imamo pravo rješenje za vas.

Također pružamo visoke kvalitete ili adaptere s pouzdanim performansama. Na primjer, našaHidraulični adapter ORFS Union Lalbow 90 °Dizajniran je za pružanje sigurnog i curenja - besplatne veze u hidrauličkim sistemima, koji je takođe metafora za stabilnu i pouzdanu vezu u genetskim konstrukcijama. Naš90 ° Podesivi klip za lakat hidraulični adapterNudi fleksibilnost u instalaciji, slično fleksibilnosti koju pružamo u prilagođavanju naših proizvoda da odgovara različitim eksperimentalnim postavkama. I našaOrfs okretni pokretači tee hidraulični apreteri i adapteriPoznati su po glatkim radu, baš kao i naši ORF-ovi i adapteri osiguravaju glatke i efikasne procese konstrukcije biblioteke.

Kontaktirajte nas za nabavku i saradnju

Ako ste zainteresirani za naše ORFS i adaptere za vaše CrisPR - biblioteke za izgradnju biblioteke zasnovane na Crispr-u, pozivamo vas da nas kontaktirate za nabavku i saradnju. Naš tim stručnjaka spreman je da vam pomogne u odabiru pravih proizvoda za vaše specifične potrebe i pružanje tehničke podrške tokom vašeg istraživačkog procesa. Bez obzira da li ste mala akademska laboratorija ili velika farmaceutska kompanija, posvećeni smo vam da vam pomognemo da postignete svoje istraživačke ciljeve sa visokim proizvodima i odličnom uslugom.

Reference

1. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., ... & Zhang, F. (2013). Multiplex genome inženjering pomoću Crispr / CAS sistema. Nauka, 339 (6121), 819 - 823.
2. Shalem, O., Sanjana, Ne, & Zhang, F. (2014). Visoka - protočna funkcionalna genomija koristeći Crispr - CAS9. Priroda recenzije Genetika, 15 (8), 591 - 603.
3. Wang, T., Wei, JJ, Sabatini, DM, & Lander, ES (2014). Genetski ekrani u ljudskim ćelijama koristeći CRISPR - CAS9 sistem. Nauka, 343 (6166), 80 - 84.